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SPE應(yīng)用一：獸藥殘留應(yīng)用
更新時間：2017-10-23
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動物組織中鹽酸克侖特羅等4種β-激動劑藥物殘留檢測（Cleanert PCX, P/N: CX1506）
1.實驗材料
1.1 固相萃取小柱：PCX(150mg/6mL)
1.2 四種β-激動劑藥物：鹽酸克侖特羅、沙丁胺醇、西馬特羅、萊克多巴胺等4種β-激動劑藥物。
2. 試料的制備
取空白樣品，經(jīng)過液液萃取初步處理后，添加適宜濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液作為空白添加試料。
3. 凈化
依次用甲醇5mL、水5mL和30mmol/L鹽酸5mL潤洗固相萃取小柱，將上述備用液過柱，依次用水5mL、甲醇5mL淋洗，真空抽干，用4%氨化甲醇5mL洗脫PCX小柱，收集洗脫液于具塞玻璃試管中，50℃下氮氣吹干。在樣液過柱和洗脫過程中流速控制在1mL/min左右。
4. 衍生化及檢測
將上述盛有殘渣的具塞玻璃試管放入50℃烘箱中加熱片刻，除去水分后，加入甲苯100mL和雙*基硅基三氟乙酰胺（BSTFA）100mL，渦旋振蕩20s，密封玻璃塞，置于80℃恒溫烘箱中加熱l小時，冷卻后加入300mL甲苯，作為試樣溶液，供氣相色譜-質(zhì)譜分析。
5. 結(jié)果
5.1 回收率實驗（精密度和準(zhǔn)確度）
將豬肝空白樣品經(jīng)過液液萃取初步處理后，分別添加一定量的標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制1μg/L、2μg/L、5μg/L、10μg/L和100μg/L五個濃度的試樣溶液，每批次內(nèi)同一濃度做5次平行實驗，共4個批次（樣品典型回收率色譜圖見附圖）。
豬肝中實驗結(jié)果列表如下
添加濃度 （μg/L） | 回收濃度 （μg/L） | 平均回收值 （μg/L） | 平均回收率 （%） | 相對標(biāo)準(zhǔn)偏差 （%） |
1 | 0.75 | 0.72 | 72.40 | 5.93 |
0.67 | ||||
0.72 | ||||
0.70 | ||||
0.78 | ||||
2 | 1.62 | 1.63 | 81.30 | 1.23 |
1.66 | ||||
1.60 | ||||
1.61 | ||||
1.64 | ||||
5 | 4.02 | 4.24 | 84.80 | 4.16 |
4.10 | ||||
4.27 | ||||
4.38 | ||||
4.43 | ||||
10 | 8.24 | 8.45 | 84.45 | 2.81 |
8.35 | ||||
8.77 | ||||
8.62 | ||||
8.25 | ||||
100 | 90.24 | 9.12 | 91.15 | 2.86 |
87.15 | ||||
91.77 | ||||
92.62 | ||||
93.95 |
5.2重復(fù)性實驗（批間誤差實驗）：
豬肝中實驗結(jié)果列表如下
批間 | 添加濃度（μg/L） | |||||||||
1 | 2 | 5 | 10 | 100 | ||||||
平均 回收率% | RSD% | 平均 回收率% | RSD% | 平均 回收率% | RSD% | 平均 回收率% | RSD% | 平均 回收率% | RSD% | |
1 | 72.40 | 5.93 | 81.30 | 3.49 | 84.80 | 6.16 | 84.45 | 3.59 | 91.15 | 2.86 |
2 | 75.37 | 6.12 | 80.47 | 5.37 | 84.74 | 7.55 | 87.46 | 4.68 | 90.05 | 3.86 |
3 | 70.09 | 7.85 | 80.80 | 6.57 | 83.10 | 8.17 | 83.21 | 5.39 | 89.53 | 4.16 |
4 | 76.73 | 4.90 | 78.50 | 8.35 | 82.90 | 5.11 | 85.95 | 5.72 | 88.27 | 5.93 |
平均值 | 73.65 | 6.20 | 80.25 | 5.95 | 83.88 | 6.75 | 85.27 | 4.84 | 89.75 | 4.20 |
RSD% | 12.95 | 10.79 | 9.43 | 7.00 | 5.75 | |||||
附圖：豬肝中0.5μg/L、1μg/L、2μg/L、5μg/L、10μg/L和100μg/L六個濃度檢測結(jié)果總離子流圖（TIC）代表圖譜：
liver+1ppb(pcx)
豬肉中五種磺胺藥物的檢測（Cleanert SUL-5, P/N: SUL-5）
一、實驗材料
1．SPE柱：Cleanert SUL-5（2g/10mL）
2．五種磺胺類藥物：磺胺二甲基嘧啶(SM2)、磺胺間甲氧嘧啶(SMM)、磺胺甲唑(SMZ) 、 磺胺二甲氧嘧啶(SDM)、磺胺喹啉(SQ)
3．標(biāo)準(zhǔn)樣品工作液
標(biāo)準(zhǔn)樣品根據(jù)NY 5029-2001附錄E配制，濃度為10mg/kg。
二、實驗過程
1.柱保留回收率實驗方法
按照NY 5029-2001附錄E中的方法進行柱保留實驗。具體步驟為：吸取50µL或100µL混合標(biāo)準(zhǔn)工作液于2.95mL或2.90mL95%乙腈中溶解，然后過已經(jīng)5mL95%乙腈活化的SUL-5小柱。具體步驟如下：
1）柱平衡：95%乙腈5mL
2）上樣（95%乙腈樣品溶液 3mL）
3）預(yù)淋洗：5mL95%乙腈淋洗
4）洗脫：70%乙腈10mL洗脫
收集洗脫液，進行HPLC分析，進樣量為20µL。
2.添加回收率實驗
按照NY 5029-2001附錄E中的方法進行添加回收率實驗。具體步驟為：稱取組織樣品5g（到0.01g）于已加有10g無水硫酸鈉的離心管中，然后加入乙腈25mL，,以10000r/min以上的速度均質(zhì)1min后，以3000r/min的速度離心5min。分離后的殘渣再用25mL乙腈處理，以3000r/min的速度離心5 min。合并兩次的上清液，加入用正己烷30mL，振蕩10min，以3000r/min的速度離心5min，取下層液體，加正丙醇10mL，50℃下減壓干燥至干，殘留物用95%乙腈3mL溶解，過堿性氧化鋁小柱。用95%乙腈5mL過柱，不收集，再用70%乙腈10mL洗脫后，收集洗脫液進行液相色譜儀測定。
3．實驗結(jié)果與分析
3．1 柱保留回收率實驗
對Cleanert SUL-5小柱分別進行了兩種濃度的柱保留回收率實驗，濃度設(shè)置相當(dāng)于實際樣品中含有100µg/kg和200µg/kg磺胺類藥物，實驗結(jié)果見表1、表2，從表中可見Cleanert小柱SM2、SMM、SMZ、SDM和SQ的平均回收率范圍分別為92.47~99.37%、93.69~99.44%、88.61~96.27%、90.87~96.06%和91.83~95.92%，效果良好；同樣從表中可見Cleanert小柱的批內(nèi)變異系數(shù)在0.30~9.38%之間，小柱的穩(wěn)定性較好。
3．2 樣品回收率實驗
對Cleanert SUL-5小柱進行了兩個濃度的回收率實驗，每個濃度6個重復(fù)，結(jié)果見表3。從表3可知Cleanert小柱在100µg/kg和200µg/kg添加濃度下，豬肉中的平均回收率在80.62~94.49%范圍內(nèi)，批內(nèi)變異系數(shù)在3.98~7.79%范圍內(nèi)，回收率高，穩(wěn)定性好。
表1. Cleanert小柱保留回收率實驗結(jié)果(濃度相當(dāng)于組織中100µg/kg)
小柱批次 | 藥物種類 | 回收率(%) 平均回收率 (%) RSD(%) |
*批
第二批
第三批 | SM2 SMM SMZ SDM SQ SM2 SMM SMZ SDM SQ SM2 SMM SMZ SDM SQ | 94.37 96.10 95.19 95.22 0.91 96.97 95.38 96.10 96.15 0.83 89.95 90.96 98.50 93.14 5.01 94.66 98.15 95.08 95.96 1.99 93.48 91.85 90.55 91.96 1.59 94.18 95.49 101.13 96.93 3.81 97.55 88.94 96.90 94.46 5.07 91.73 87.87 94.46 91.35 3.62 87.22 99.60 97.87 94.90 7.06 92.18 94.80 93.17 93.38 1.43 95.08 94.76 94.52 94.79 0.30 99.63 95.11 95.96 96.90 2.48 96.40 98.16 87.26 93.94 6.23 96.79 96.66 94.55 96.00 1.31 96.32 91.38 92.49 91.93 0.85 |
表2. Cleanert小柱保留回收率實驗結(jié)果(濃度相當(dāng)于組織中200µg/kg)
小柱批次 | 藥物種類 | 回收率(%) 平均回收率 (%) RSD(%) |
第三批
第四批
第五批 | SM2 SMM SMZ SDM SQ SM2 SMM SMZ SDM SQ SM2 SMM SMZ SDM SQ | 99.66 99.26 98.75 99.22 0.46 97.46 100.25 96.37 98.03 2.04 96.35 94.42 97.06 95.94 1.42 94.97 94.86 98.34 96.06 2.06 98.22 91.96 97.59 95.92 3.59 100.45 85.90 91.06 92.47 7.97 94.67 88.58 97.83 93.69 5.02 95.96 81.25 88.63 88.61 8.30 99.83 82.87 89.90 90.87 9.38 96.21 87.89 91.40 91.83 4.54 98.69 100.31 99.11 99.37 0.85 101.51 100.78 96.04 99.44 2.99 91.35 98.78 98.68 96.27 4.43 92.75 97.29 97.88 95.97 2.92 84.27 98.61 98.20 93.69 8.71 |
表3. Cleanert小柱豬肉樣品回收率實驗結(jié)果
添加濃度（µg/kg） | 藥物種類 | 回收率(%) 平均回收率 (%) RSD(%) |
100
200 | SM2 SMM SMZ SDM SQ SM2 SMM SMZ SDM SQ | 93.39 97.95 98.87 90.33 98.27 88.14 94.49 4.83 97.46 90.66 94.33 81.83 93.64 96.50 92.40 6.17 83.78 88.45 94.40 80.24 82.04 80.30 84.87 6.56 91.26 96.75 91.79 87.57 85.88 88.43 90.28 4.30 88.44 85.14 92.61 81.03 79.57 83.59 85.06 5.69 80.85 77.37 88.39 90.53 73.80 81.17 82.02 7.79 91.79 88.87 96.23 92.96 87.01 87.36 90.70 3.98 79.60 77.27 87.34 86.98 75.44 82.47 81.52 6.09 84.31 72.35 84.52 81.92 82.53 78.10 80.62 5.79 91.93 81.86 91.83 87.89 86.90 86.17 87.76 4.33 |
水產(chǎn)品、進口肉中土霉素、四環(huán)素、金霉素含量檢測方法（Cleanert PS, P/N: PS2003）
1．SPE柱：Cleanert PS柱（200mg/3mL）
2．樣品處理
稱取5g經(jīng)勻漿處理的樣品于100mL離心管內(nèi)，分別加入含有EDTA2Na的檸檬酸緩沖液30mL、20mL，混合震蕩提取，合并上清液。加入20mL正己烷和上清液于分液漏斗中，充分混合震蕩5min，合并下層。
含有EDTA2Na檸檬酸緩沖液的配制：取0.1mol/L檸檬酸緩沖溶液307mL和0.5mol/L磷酸氫二鈉緩沖溶液193mL混合均勻，向其中加入1.86gEDTA2Na，溶解后作為樣品提取液。
3．凈化步驟：
以10mL甲醇，10mL水，5mL EDTA2Na活化PS柱，加入上清液，然后以10mL水淋洗小柱，抽干，zui后以10mL甲醇洗脫目標(biāo)物，并收集。
4．濃縮及定容：
濃縮：在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上減壓濃縮，溫度小于40℃
定容：加入1.0mL的1.36%的磷酸二氫鉀溶液，將定容液進行HPLC分析
5．HPLC條件
色譜柱：Venusil MP C18, 5µm,4.6*250mm
流動相：A:B=77:23
A：咪唑緩沖液—稱取68.08咪，10.72乙酸鎂，0.37EDTA2Na 溶于800mL水中，用冰乙酸調(diào)pH到7.2，加水定容到1000mL.
B：乙腈
6．結(jié)果：（兩個平行）
名稱 | 回收率-1 | 回收率-2 |
土霉素 | 128% | 137% |
四環(huán)素 | 91.8% | 97.4% |
金霉素 | 88.5% | 87.1% |
強力霉素 | 97.3% | 95.3% |
蜂蜜中四環(huán)素檢測（Cleanert PEP,Cleanert COOH,P/N：PE5006,CH5003）
- 樣品制備：稱6g蜂蜜樣品+30mL提取液（PH=4.0），旋渦振蕩
提取液配制：檸檬酸10.5g+磷酸氫二鈉（無水）8.88g+乙二胺四乙酸鈉30.3g+820mL水，用2M HCl調(diào)PH至4.0）
2．SPE步驟
① PEP(500mg/6mL)
活化：甲醇，水
上樣：把樣品提取液過柱
淋洗：5%甲醇/水 5mL,抽干
②COOH(500mg/3mL)
活化：乙酸乙酯，2柱管
③PEP（上）-COOH（下） 串聯(lián)
淋洗： 15mL乙酸乙酯淋洗，拿下PEP柱，COOH柱抽干（5min）
洗脫： 流動相（0.01M草酸：乙腈：甲醇=350：100：50）4.5mL
定容： 洗脫液用0.01M草酸定容至5mL,搖勻，過濾膜，UPLC測定。
硝基呋喃類代謝物殘留量的LC/MS測定方法 (Cleanert PEP，P/N:PE0603)
1．材料：SPE柱：PEP(60mg/3mL)
2．樣品制備
2．1 奶粉和牛奶樣品處理
2.1.1 樣品處理：奶粉1g(牛奶稱5g)，加15 mL三氯乙酸-水混合溶液（2+1，5mol）,加內(nèi)標(biāo)，加混標(biāo)，37.5℃水浴水解5小時，取出后4000 rpm離心5min，取上清液待用。
2.1.2 樣品初步凈化及衍生：PEP柱以5mL甲醇，5mL水活化，后把2.1.1處理好的上清液過柱，待樣液全部通過固相萃取柱后用5ml的三氯乙酸淋洗全部收集到另一個管中，加100μl衍生劑(20mg而硝基苯甲醛溶于1ml二甲亞砜)，放入37.5℃水浴中衍生16小時（過夜）。
2．2 豬肉、牛肉、雞肉、豬肝和水產(chǎn)品和蜂蜜樣品處理
2.2.1樣品粗處理：豬肉、牛肉、雞肉、豬肝和水產(chǎn)品稱2g（蜂蜜稱5g），加入15mL甲醇-水混合溶液（2+1），渦旋，混勻， 4000 rpm離心5min，吸取上清液，加入內(nèi)標(biāo)及混標(biāo)。
2.2.2 衍生：在上述上清液中加100μL衍生劑(20mg而硝基苯甲醛溶于1mL二甲亞砜)，放入37.5℃水浴中衍生16小時（過夜）。加磷酸氫二鉀緩沖液5mL（pH約為7.4），4000 rpm離心10 min，（若待測樣品含脂肪較多，上清液加5 mL正己烷，振蕩2 min，4000 rpm離心10 min吸取并棄掉正己烷）
3．PEP柱凈化
1) 活化：PEP柱以5mL甲醇，5mL水活化
2) 上樣：將2.2.1或2.2.2中的衍生液加磷酸氫二鉀緩沖液5ml，用1mol/l氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液pH約為7.4，4000 r/min離心10 min，上清液（若待測樣品含脂肪較多，上清液加5 mL正己烷，振蕩2 min，4000 r/min離心10 min吸取并棄掉正己烷）以小于2 mL/min的流速通過PEP柱
3) 淋洗：以10 mL水洗滌固相萃取柱，棄去全部流出液。用真空泵在65 kPa負(fù)壓下抽干PEP固相萃取柱15 min。
4) 洗脫：用5 mL乙酸乙酯洗脫被測物于25 mL棕色離心管中。
5) 濃縮：洗脫液在40℃水浴中氮氣吹干，用樣品定容液溶解并定容至1.0 mL，混勻后過0.2μm濾膜用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定。
動物性食品中糖皮質(zhì)激素類藥物多殘留LC/MS檢測方法 (Cleanert Silica, P/N:SI5006)
1．固相萃取柱：Cleanert Silica，500mg/6ml
2．提取
2.1肌肉組織樣品
稱取組織試料5g（±0.05g）于50mL離心管中，加30mL乙酸乙酯, 10g無水硫酸鈉，均質(zhì)1min，200r/min搖床振動20 min，4200r/min離心10min,移取乙酸乙酯層。殘渣中加乙酸乙酯25mL, 均質(zhì)1min，200r/min搖床振動20 min，4200r/min離心10min,移取乙酸乙酯層。合并兩次提取液，40℃旋轉(zhuǎn)至近干，加乙酸乙酯1mL和正已烷5mL,溶解殘渣,待凈化。
2.2 牛奶、雞蛋樣品
稱取牛奶或雞蛋試料5g（±0.05g）于50mL離心管中，加30mL乙酸乙酯,均質(zhì)1min，200r/min搖床振動20 min，4200r/min離心10min,移取乙酸乙酯層。殘渣中加乙酸乙酯25mL，均質(zhì)1min，200r/min搖床振動20 min，4200r/min離心10min，移取乙酸乙酯層。合并兩次提取液，40℃旋轉(zhuǎn)至近干，加乙酸乙酯1mL和正已烷5mL,溶解殘渣,待凈化。
3．凈化
用正已烷6mL活化Silica柱，提取液過柱。用正已烷6mL淋洗萃取柱，抽干，用正已烷-丙酮(6/4,V/V)6mL洗脫。洗脫液50℃氮氣吹干，加20%乙腈水溶液0.5mL,溶解殘渣，轉(zhuǎn)入1.5mL離心管中，4200r/min離心20min，取上清液，過0.22um濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定。
動物源食品中玉米赤霉醇類藥物殘留LC/MS檢測 (Cleanert NH2, PAX, P/N:NH5006, AX1506)
1.SPE柱：Cleanert NH2:500mg/6mL, PAX: 150mg/6mL
2.樣品處理
2.1肌肉組織樣品
2.1.1 提?。悍Q取5g（±0.05g）于50mL離心管中，加甲醇15mL,渦旋1min,4000r/min離心10min,取上清液于另一離心管中。重復(fù)提取一次，合并兩次提取液。加正已烷20mL,手搖20次，3000r/min離心5min,棄上層正已烷。再加正已烷20mL重復(fù)脫脂一次。下層轉(zhuǎn)至100mL雞心瓶中，50℃旋蒸至近干，加乙酸乙酯5mL,渦動1min,靜置10s,上清液轉(zhuǎn)移至同一個離心管。再用正已烷10mL洗滌雞心瓶一次，合并三次殘余物溶解液，備用。
2.1.2凈化：氨基柱上加無水硫酸鈉2g，用玻璃棒敲勻。依次用乙酸乙酯和正已烷各5mL活化，取備用液全部過柱，再依次用正已烷、正已烷-乙酸乙酯(60+40,v/v)各5mL淋洗。依次用正已烷-乙酸乙酯（20+80，V/V）和乙酸乙酯各4mL洗脫，合并兩次洗脫液，50℃氮氣吹干。
2.1.3凈化：殘余物中加乙腈0.5mL,渦動1min，加水0.5mL,混勻，過0.2um有機濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。
2.2 肝臟組織樣品
2.2.1 稱取5g（±0.05g）于50mL離心管中，加甲醇10mL,渦旋1min,4000r/min離心5min,取上清液于另一離心管中。重復(fù)提取一次，合并兩次提取液。加正已烷10mL,手搖20次，3000r/min離心5min,棄上層正已烷。下層于50℃氮氣吹干，加乙酸乙酯5mL,渦動1min,再加正已烷20mL渦動30s, 4000r/min離心5min,取上清液備用。
2.2.2 凈化：氨基柱上加無水硫酸鈉2g，用玻璃棒敲勻。依次用乙酸乙酯和正已烷各5mL活化，取備用液全部過柱，再依次用正已烷、正已烷-乙酸乙酯(45+55,v/v)各5mL淋洗。依次用正已烷-乙酸乙酯（20+80，V/V）和2%甲醇乙酸乙酯各5mL洗脫，合并兩次洗脫液，50℃氮氣吹干。
2.2.3凈化：殘余物中加乙腈0.5mL,渦動1min，加水0.5mL,混勻，加正已烷2mL,渦動30s,9000r/min離心5min,取下層清液，過0.2um有機濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。
2.3 牛奶樣品
2.3.1 提取：量取5.0mL試料于50mL離心管中，加18%的硫酸溶液0.1mL,渦勻，靜置10min,加正已烷10mL和乙腈20mL，300r/min振蕩10min，4000r/min離心10min，棄正已烷層。取提取液12.5mL于離心管中，50℃氮吹至小于0.1mL。加水10mL,用5mol/lNaOH調(diào)節(jié)Ph值至11，9000r/min離心5min,備用。
2.3.3 凈化：Cleanert PAX固相萃取柱依次用甲醇、水各2mL活化和平衡，將備用液過柱，依次用甲醇-氨水-水（5+5+90,V/V/V）1mL和甲醇0.5mL洗滌，用2%乙酸乙腈4mL洗脫，收集洗脫液，50℃下氮氣吹干。
2.3.3凈化：殘余物中加乙腈0.5mL,渦動1min，加水0.5mL,混勻，過0.2µm有機濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。
2.4 雞蛋樣品
2.4.1提取：稱取5g（±0.05g）于50mL離心管中，加乙腈10mL,渦動1min,9000r/min離心5min，取上清液于另一立新觀眾。重復(fù)提取一次，合并兩次提取液。取12.5mL于離心管中，50℃氮吹至小于0.1mL。加水10mL,用5mol/lNaOH調(diào)節(jié)Ph值至11，9000r/min離心5min，備用。
2.4.2凈化：Cleanert PAX固相萃取柱依次用甲醇、水各2mL活化和平衡，將備用液過柱，依次用甲醇-氨水-水（5+5+90,V/V/V）1mL和甲醇0.5mL洗滌，用2%乙酸乙腈4mL洗脫，收集洗脫液，50℃下氮氣吹干。
2.2.3凈化：殘余物中加乙腈0.5mL，渦動1min，加水0.5mL,混勻，過0.2µm有機濾膜，供液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀測定。
